lundi 30 décembre 2013

Paludisme - Tazomoka - 5

Nous voici aux termes de cette série sur la malaria.

Le hasard a voulu qu'en 1990, dès la sortie de l'école de laborantin (Hôpital d'Instruction des Armées Desgenettes - Lyon), je rejoigne l'équipe de recherche sur le paludisme pour y passer huit années de ma vie (Institut de Médecine Tropicale du Service de Santé des Armées - Marseille).

Le discours d'accueil de mon professeur agrégé de patron fut "d'oublier tout ce que j'ai appris au sujet des analyses médicales" afin de m'ouvrir aux techniques de culture cellulaire !

Notons au passage que dans le cadre de la recherche, nous étions tenus à noter scrupuleusement tout ce que l’on entreprend et dans les moindres détails (et surtout en cas de non respect des protocoles). Ceci, afin de pouvoir respecter la reproductibilité d’un résultat. Si bien que la traçabilité est vite devenue le fil d’Ariane de chacun de nous.

Ainsi, je commençais mes journées par changer les milieux de culture des hématies, tout en tirant des lames (frottis sanguins) afin de faire les « parasitémies » des divers souches en culture. Heureusement, nous disposions de kit de coloration rapide pour ce faire.


Recherche au microscope (voir la vidéo
Une de mes tâches consistait aussi à préparer les milieux de culture. La plus évidente fut de reconstituer les diverses solutions et de les autoclaver. Celle qui était plus fastidieuse fut de récupérer des poches de plasma humain congelées afin de fournir le sérum indispensable pour suppléter à 10% les dits milieux de culture. Enfin, de temps en temps, il était aussi question de préparer un cocktail radioactif (hypoxanthine tritié) pour le marquage des parasites avant l’extraction des antigènes du plasmodium, mais aussi dans le cadre des fameux tests de chimio sensibilité aux anti malariques.

Changement de milieu de culture

Toutes ces manipulations se faisaient sous hotte à flux horizontal au début. Ce n’est que beaucoup plus tard que les normes imposaient l’acquisition de hotte à flux laminaire. Peu de temps avant que je quitte le centre de recherche, nous travaillons en ambiance confinée type PII bis !

Ambiance en culture cellulaire

L’objet de tous ces soins est sa majesté Plasmodium falciparum. Effectivement, seule cette souche pousse en culture. Nous avons aussi la responsabilité d’isoler les souches provenant des impaludés (militaires et civils) des hôpitaux métropolitains mais aussi d’Afrique. Si bien que l’unité de recherche dispose d’une riche banque conservée dans de l’azote liquide. La congélation et la décongélation des souches incombe aussi aux techniciens de laboratoire.


Décongélation

Enfin, nous passons aussi une partie de notre temps à entretenir l’animalerie. Entre autres, le nettoyage des cages de souris. Ces dernières servaient à produire des anticorps monoclonaux. Le prélèvement d’ascite sur ces pauvres bêtes au ventre gonflée comme des montgolfières fut toujours une tâche délicate et difficile psychologiquement, étant donnée la souffrance qu’elles enduraient.

L’autre difficulté de ce métier, c’est de ne pas souiller les boîtes de culture. Au départ en boîte de Pétri, puis en flasque dès lors qu’il fallait passer à la production d’antigène pour l’autre équipe qui étudiait chaque fraction des gènes du parasite. Donc, il fallait tenir compte de l’indice de multiplication de la souche afin de prévoir les « divisions » des boîtes de culture. En terme plus simple, il fallait diluer la suspension hématies parasitée par une suspension d’hématies saines. Ici encore, c’était la banque de sang de l’hôpital militaire de Toulon qui nous fournissait les poches d’hématies saines. Ces dernières devaient au préalable subir des séries de lavages (centrifugation dans des milieux de culture) pour être conservées quelques jours au réfrigérateur.

Je vous renvoie aux articles précédents pour ce qui est du cycle de reproduction du Plasmodium falciparum. Effectivement, il fallait régulièrement « resynchroniser » chaque souche afin d'obtenir une population homogène. Cela consiste à traiter au sorbitol une culture où cohabitaient : les trophozoïtes (formes jeunes en bague à chaton) et les schizontes (formes âgées à noyau multiple). A l’issue, les hématies parasitées par les schizontes s’hémolysent et ne subsistent que celles parasitées par les trophozoïtes. C’est une étape indispensable avant chaque production massive d’antigène palsmodial.


Cycle parasitaire (vidéo intéressantemusique bizarre...  

La récolte se fait à un stade ciblé en fonction des protocoles de recherche établis. En général, les schizontes matures - voire les rosaces - sont préférés car à ce stade, le parasite dispose d’un maximum de matériel antigénique. Compte tenu du cycle parasitaire et malgré tous les soins apportés à la culture, le plasmodium arrive à maturité bien souvent en pleine nuit. Ainsi je profitais de mes tours de garde administrative (comme sous-officier) pour effectuer le fameux « percoll ». Ce protocole délicat et long m’occupait au laboratoire, au lieu de passer bêtement mes nuits devant le poste de télévision dans ma salle de garde.

L’extraction d’antigène parasitaire commençait par une série de lavages (centrifugation) des cultures (hématies parasitées). Entretemps, je préparais deux dilutions de solution de silice avec du sorbitol. Le plus dur était de déposer délicatement celle de 90% au fond du tube à centrifuger, puis celle 70% juste au dessus. Ici tout tremblement est interdit. Enfin, cerise sur le gâteau, il fallait déposait une suspension d’hématies parasitées en guise de troisième et dernière phase supérieur.

Percoll Sorbitol (source)
L’ultracentrifugation faisait son reste. Et si j’ai été assez méticuleux, j’aurais la joie de récolter délicatement parmi plusieurs phases (bandes colorées différemment et séparées en fonction de leurs densités) celle qui m’intéresse.

Les schizontes se retrouveront dans une bande noire spécifique : un anneau sombre. Les trophozoïtes seront (toujours intra érythrocytaires) en interphase et moins dense.

Cette technique permettra une synchronisation partielle car on pourra les remettre en culture par la suite.

Une fois avoir congelés les schizontes, je peux enfin rejoindre mon poste de garde et me coucher. 

Telle est le fragment de vie d’un technicien de laboratoire dans une équipe de recherche sur le paludisme. Je vous fait grâce des protocoles de préparations des plaques d’anti malariques pour les tests de chimio sensibilité - ou de chimiorésistance ça dépend sous quel angle on voit les choses !

En plus du côté technique de ce métier, une motivation particulière ne m’a jamais quitté car ma famille à Madagascar fait partie des personnes potentiellement victime du paludisme, comme tant d’autres individus dans le monde intertropical.



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Mise à jour ce 27.02.2017 :

     Voici des planches pratiques pour le diagnostic microscopique afin de différencier les espèces de Plasmodium :

     

      

Elles sont tirées d'un document officiel de l'OMS : 

(lire le document)
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Mise à jour ce 30.04.2017 :
    Quand j'étais technicien à l'IMTSSA, j'ai eu l'occasion de travailler avec le Dr.  Milijaona Randrianarivelojosia. Aujourd'hui il est le chef du département paludisme de l'IPP d'Antananarivo.

(source)



4 commentaires:

  1. Parfois je me demande ce que tu fais dans notre petit groupement de laboratoires de biologie médicale, avec tes références tu mériterais beaucoup mieux

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  2. Merci pour ton commentaire, que je vais essayer de répondre.
    Dès fois, certaines circonstances nous conduisent vers une voie tout à fait inattendue.
    J’ai quitté cette équipe de recherche car la limite d’âge me guettait. Il en est ainsi : pas de sécurité d’emploi dans l’armée, dès lors que votre avancement est gelé. Pourtant, c’était l’époque de la suppression du service militaire et l’armée était en sous-effectif de paramédicaux ! Ainsi, j’ai anticipé la mise à la porte en postulant dans le privé.
    J’ai démissionné de l’armée dès lors qu’une proposition d’embauche dans un centre de procréation médicale assisté s’est terminée par la signature d’un contrat. L’expérience en culture cellulaire m’a été favorable.
    Un peu plus tard, il a fallu déménager pour permettre à mes enfants de poursuivre leurs études supérieures. Donc un nouveau rebondissement dans ma carrière et me voilà dans l’analyse médicale, pour lequel j’ai été formé en 1990. Effectivement, c’est encore l’armée qui m’a permis d’accéder à cette formation. Nous étions quatre à avoir réussi le concours d’entrée et 8 médecins et pharmaciens nous dispensaient les cours. Les après-midi étaient réservés aux travaux pratiques. Cependant, nous avons passés le même examen que les étudiants civils à la « fac catho » de Lyon.
    Après ce périple, me voilà dans ce groupement de laboratoires que tu qualifies de « petit ».
    D’une part, je suis d’accord sur ce qualificatif, car j’ai du mal à considérer que les personnes que je prélève ne sont plus des patients mais des clients. Il n’est plus question de service de santé mais de commerce !
    D’autre part, être employé dans ces laboratoires m’a donné l’occasion de rencontrer des gens comme toi. C’est une richesse car cela m’a permis d’avoir une expérience syndicale, qui manquait dans mon parcours et que je pourrais partager à mes enfants.
    Je tiens aussi à témoigner qu’un biologiste (pas du même groupe) m’a fait confiance et m’a payé un stage AFGSU et un stage chez Beckman Coulter à Villepinte (une semaine de logement dans un hôtel trois étoiles place l’Opéra) alors que je n’étais que stagiaire dans son labo. A mon retour, j’ai pu m’investir dans mon travail car j’étais bien considéré… Comme quoi, il y a des patrons intelligents et humains !

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  3. Les animations permettent de mieux comprendre.

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    1. Effectivement et ces planches vous aideront à différencier les espèces de Plasmodium.

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